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Bem-vindo à Série Novus Protocolo Visual.
Neste vídeo vamos aprender como executar todas as fases de um Western Blot usando o
métodos mais comuns para este ensaio.
Antes que possamos começar a preparar a mancha é preciso primeiro preparar a nossa lisado amostra.
Nesse exemplo vamos preparar um lisado de proteína a partir de células cultivadas.
Aqui
que lavar as células duas vezes com PBS gelado
e tampão de lise suficiente para cobrir as células.
A escolha do tampão de lise depende muito do seu
escolha da proteína de interesse.
Nós raspar as células e transferir a solução da célula em um tubo de centrífuga
colocada em gelo.
A fim de solubilizar as proteínas da membrana ligadas, que implica um reforço
detergentes de extracção em comparação com isolados de proteínas citoplasmáticas.
Neste exemplo
estamos usando um tampão RIPA padrão,
que é um tampão comum para obtenção de rendimento máximo de proteína. Ao extrair
proteínas a partir de todas as localizações celulares,
é muito importante de modo a incluir os inibidores da protease no seu tampão de lise, que irá
prevenir a degradação da sua amostra. Sempre use protease preparada na hora
inibidores, manter amostras de gelo e trabalhar rapidamente.
Nós, os piolhos das células por pipetagem cima e para baixo
seguido de incubação em gelo durante 30 minutos.
Centrifugar as células em um pellet.
Descartar o sedimento e recolher o sobrenadante. Este é o seu lisado.
Determinar a concentração total de proteína por seu lisado
*** de uma pequena porção do seu lisado
com um ensaio de quantificação de proteínas comercialmente disponível
tais como o BCA.
Isso vai ajudá-lo a carregar a mesma quantidade de proteína em seu gel.
Western Blots são tipicamente pré-formado sob reduzida e desnaturada
condições. Estas condições permitem que as proteínas sejam separados pela
peso molecular
em vez de sua forma nativa conformacional ou encargo.
Para reduzir e desnaturar as amostras,
diluir cada um em um tampão de carga, tais como o tampão de Laemmli tradicional.
Este tampão contém beta-mercaptoetanol, DTT, ou, para reduzir os cumes dissulfureto
entre as cisteínas,
SDS para ajudar desnaturação de uma proteína líquida negativa,
glicerol para permitir que as amostras a afundar-se em cada cavidade,
azul de bromofenol a visualizar o lisado e um buffer de ícone.
Votex cada amostra a 95 graus Celsius, durante cinco minutos para
completamente desnaturar as proteínas. Agora você está pronto para carregar suas amostras
num gel de SDS-page.
Para esta próxima etapa, vamos separar as proteínas individuais, em nossa amostra
lisado
com base no seu peso molecular
usando um eléctrodo positivo para atrair uma proteína carregada negativamente.
Para fazer isso
nós carregamos nossas amostras de proteínas, previamente preparados em uma comercialmente disponível
gel de poliacrilamida.
Géis estão disponíveis em percentagens fixas ou gradientes de acrilamida.
Quanto maior for a acrilamida menor a proporção de gel
percentagem.
Portanto géis maiores percentuais são melhores para proteínas de baixo peso, baixo percentual
géis são melhores para as proteínas de grande peso e géis de gradiente podem ser utilizados para
proteínas de todos os tamanhos
devido à sua ampla variação no tamanho dos poros.
Preparar o gel, inserindo-o no interior do aparelho de electroforese e
enchimento com tampão de corrida que é apropriado para sua química gel.
Enxaguar os poços do gel com tampão de corrida e adicionar ao tampão
câmaras.
Carregar suas amostras para os poços.
Se você não tem certeza do valor a carregar,
10-30 microgramas de proteína total é um ponto de partida sugerido
, bem como a totalidade da amostra carregada.
Você também vai precisar de reservar pelo menos um bem para o peso molecular pré-corados
escada.
A escada vai permitir que você monitore a separação de proteínas durante a
eletroforese e, posteriormente, verificar peso proteína em sua amostra durante
posterior análise.
Feche a unidade de eletroforese e conectá-lo a uma fonte de alimentação. A maioria das unidades
funcionam tipicamente 45-60 minutos a 200 volts
ou até que o tampão de carga atinge o fundo do gel.
Durante este tempo, as proteínas carregadas negativamente, em cada amostra irá migrar para
o eletrodo de carga positiva fazendo o seu caminho através da poliacrilamida
gel matriz.
Neste passo seguinte, transferimos nossas proteínas separadas para fora do gel
e em uma membrana sólida ou blot.
Isto baseia-se no mesmo princípio como o passo anterior
no qual um campo eléctrico é carregada para remover as proteínas negativas
no sentido de um eléctrodo positivo.
Transferência pode ocorrer em condições húmidas ou semi-seca.
Aqui vamos demonstrar o método de transferência tradicional molhado. Comece removendo
o gel a partir da sua cassete
corte a parte superior que contém os poços.
Entalhar o canto superior esquerdo para orientação gel indicado.
Flutuar o gel em tampão de transferência durante a preparação do sanduíche de transferência.
Para fazer com que a sanduíche de transferência
você vai precisar de um cassete,
esponja, papel de filtro
o gel
e sua escolha de PVDF ou membrana nitrocellulous.
PVDF tem de ser activada por imersão da membrana em etanol para
de dois minutos. Mas diferente do que esta a PVDF ou escolha de nitrocellulous
membrana é uma preferência pessoal.
Entalhar o canto superior esquerdo para indicar a orientação blot
e incubar as membranas em tampão de transferência durante 10 minutos.
Criar uma pilha, colocando os seguintes componentes
do cátodo preto negativo para anodo positivo vermelho:
esponja,
papel de filtro,
membrana,
(Tenha cuidado para não tocar no gel ou membrana com as mãos e usar
pinças limpas ou espátula em vez disso.
Tocar a membrana durante qualquer fase pode contaminar o blot e levar a
sinal de fundo excessivo. ),
papel-filtro
e esponja.
Use um rolo limpo, com cada camada suavemente para lançar as bolhas que podem ser
apresentar
desde que as bolhas irão inibir a transferência de proteínas eficiente.
Bloquear a cassete e colocá-la no aparelho que contém a frio
transferir tampão
assegurar que a cassete está posicionada corretamente de negativo para positivo.
A fim de evitar a acumulação de calor, é benéfico para transferir com um frio
embalar no aparelho
aparelho ou numa câmara fria com o spinner barra colocada na parte inferior da câmara.
Feche a câmara e se conectar a uma fonte de alimentação.
Executar a transferência de acordo com as instruções do fabricante que está
normalmente 100 volts durante 30-120 minutos.
Após electrotransferência das nossas proteínas para uma membrana, iremos
agora bloquear o blot,
aplicar um anticorpo específico para o nosso principal proteína de interesse e, em seguida, um derivado
anticorpo que reconhece o anticorpo primário.
Começar por remover a membrana a partir da cassete e lavagem três vezes em água.
Como etapa opcional, podemos verificar as proteínas foram transferidas com sucesso
por coloração da membrana com Ponceau vermelho.
Incubar a membrana em ponceau durante cinco minutos e lava-se com água até
as bandas são claras.
Após a verificação
a mancha pode ser de-corados, continuando a lavar com água
ou TBS fio
até que o corante é removido completamente.
Temos de bloquear todas as áreas da mancha que não contêm proteína.
Isto irá impedir a ligação não específica do anticorpo e reduzir globalmente
sinal de fundo.
Comuns tampões bloqueadores incluem 5% de leite seco não gordo para o ensaio
em uma solução de TBS fio.
No entanto, não usar leite quando sondagem com anticorpos específicos fosfo
uma vez que pode causar um fundo elevado a partir da sua fosfoproteína endógena, césio.
Incubar a membrana com uma solução de bloqueio durante uma hora à sala
temperatura
sob agitação leve.
Decantar a solução de bloqueamento e lavar com TBS durante cinco minutos cordel.
Agora estamos prontos para adicionar o nosso anticorpos. Dilui-se o anticorpo primário em uma
tampão de bloqueio na concentração recomendada na folha de dados.
Incubar durante uma noite a 4 graus Celsius, com agitação suave.
Um passo opcional é recomendado usar também um anticorpo de controlo positivo
que permite que o utilizador verifique se quantidades iguais de proteína total foram carregados em
cada poço e assessores na solução de problemas, removendo qualquer
incertezas com o procedimento de Western Blot.
No dia seguinte,
decantar o anticorpo primário e lava-se a membrana com grandes volumes
da TBS fio e agitação vigorosa
cinco vezes durante cinco minutos cada.
Estas lavagens rigorosas são de extrema importância para a remoção de não-específica
sinais de fundo.
Após a lavagem, o anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio e incubar
a membrana durante uma hora à temperatura ambiente na concentração
recomendado na folha de dados.
No nosso exemplo, o derivado é também conjugado com HRP para posterior
detecção.
Membrana decantar e lavagem secundário com grandes volumes de TBS com fio
agitação vigorosa cinco vezes durante cinco minutos cada.
Agora você está pronto para a fase de detecção.
Nesta última fase, iremos demonstrar o desenvolvimento de sinal utilizando o mais comum,
método de detecção mais sensível e mais barato do eletroquimioluminescência
(Ou ECL) de reacção.
Este método utiliza a enzima HRP,
que foi conjugado com o secundário para catalisar a reacção de ECL e produzir
luz.
A luz é então recolhida sobre filme de raios-x e desenvolvido
ou digitalizadas com a ajuda de uma câmara especializada suficientemente sensível
para esta aplicação.
Começamos por mistura de partes iguais de reagentes ECL na proporção de um-para-um
de acordo com as instruções do fabricante.
Iremos incubar a membrana durante 3-5 minutos sem agitação.
Após a incubação, a mistura de ECL decantar e usar um laboratório limpar para remover o excesso
solução a partir do canto da membrana.
Coloque a membrana em um envoltório de plástico transparente, como um protetor da folha para evitar
secagem. Evite deixar a membrana secar completamente.
Podemos agora usar um rolo para empurrar as bolhas ou qualquer excesso de solução.
Imediatamente desenvolver a membrana.
Ambos os sistemas de cinema e câmera permite que você ajuste manualmente o tempo de exposição
a fim de garantir uma imagem perfeita Blot Western.
As densidades relativas de banda podem agora ser quantificados com comercialmente disponível
software.
. Peso molecular apropriado também pode ser verificada através da comparação com o tamanho da banda
escada de peso molecular.