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Com as células plaqueadas no dia anterior e durante a noite de cultura, estamos prontos
para iniciar o procedimento ICC.
Neste primeiro dia do ICC, vamos corrigir,
permeabilizar,
blot e adicionar um anticorpo primário às células.
Iniciar o meio de cultura por aspiração de cada poço seguido de fixação do
células com formaldeído a 4% ou 10% de formalina
durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar fixador e lavar cada poço duas vezes com PBS gelado.
Tenha cuidado para não permitir que as células secar neste
ou qualquer passo do protocolo.
Se o epítopo da sua proteína de interesse é expressa intracelularmente,
permeabilização celular é necessária para o anticorpo para obter acesso ao
célula.
Embora existam muitos agentes de permeabilização diferentes, o mais comum
são 0,1 - 0,5% de concentração de Tween-20, ou
Triton X100
diluído em PBS.
Tween-20 é utilizado para a epitopos localizados no citoplasma
enquanto Triton X100-é utilizado para permeabilização do núcleo e as mitocôndrias.
Incubar os poços com tampão de permeabilização durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar tampão de permeabilização e lavar três vezes durante 5 minutos
cada com PBS fio.
PBS fio contém 0,1% de Tween-20.
Vamos agora bloquear locais de ligação não específicos com tampão de bloqueio durante 1 hora
à temperatura ambiente.
O tampão de bloqueio é melhor PBST contendo 10% de soro a partir do
acolher espécies de seu anticorpo secundário.
No entanto, BSA a 1% em PBST podem também ser usados.
Preparar o anticorpo primário por diluição em tampão de bloqueamento no recomendada
diluição especificado na folha de dados.
Múltiplas diluições mais apertados são benéficas para dar conta variáveis que
pode ser diferente em seu ensaio e
para alcançar os melhores resultados.
Incubar a 4 graus Celsius, durante a noite.
No nosso exemplo, já que estamos usando um primário não conjugada estaremos usando um fluoróforo
secundário conjugado no dia dois.