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Após electrotransferência das nossas proteínas para uma membrana, vamos agora bloquear o
Blot,
aplicar um anticorpo específico para o nosso principal proteína de interesse e, em seguida, um anticorpo secundário
que reconhece o anticorpo primário.
Começar por remover a membrana a partir da cassete e lavagem três vezes em
água.
Como etapa opcional, podemos verificar as proteínas foram transferidas com sucesso
por coloração da membrana com Ponceau vermelho.
Incubar a membrana em ponceau durante cinco minutos e lava-se com água até
as bandas são claras.
Após verificação, o blot pode então ser de-corados, continuando a lavar com
água ou TBS fio até que o corante é removido completamente.
Precisamos bloquear todas as áreas da mancha, que já não contêm proteínas.
Isto irá impedir a ligação não específica do anticorpo e reduzir globalmente
sinal de fundo.
Comuns tampões bloqueadores incluem 5% de leite seco não gordo para o ensaio
em uma solução de TBS fio.
No entanto, não usar leite quando sondagem com anticorpos específicos fosfo como pode
causar fundo elevado a partir da sua fosfoproteína endógena, césio.
Incubar a membrana com uma solução de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente
sob agitação leve.
Decantar a solução de bloqueamento e lavar com TBS durante cinco minutos cordel.
Agora estamos prontos para adicionar o nosso anticorpos. Dilui-se o anticorpo primário em uma
tampão de bloqueio na concentração recomendada na folha de dados.
Incubar durante uma noite a 4 graus Celsius, com agitação suave.
Um passo opcional é recomendado usar também um anticorpo de controlo positivo carregado
que permite que o utilizador verifique se quantidades iguais de proteína total foram carregados em cada
bem e assessores na solução de problemas através da remoção de quaisquer incertezas
com o procedimento de Western Blot. No dia seguinte, decantar o anticorpo primário e
lavar a membrana com grandes volumes de TBS fio e agitação vigorosa
cinco vezes durante cinco minutos cada.
Estas lavagens rigorosas são de extrema importância para a remoção de não-específica
sinais de fundo.
Após a lavagem, o anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio e
incubar a membrana durante uma hora à temperatura ambiente na concentração
recomendado na folha de dados.
No nosso exemplo, o derivado é também conjugado com HRP para posterior
detecção.
Membrana decantar e lavagem secundário com grandes volumes de TBS com fio
agitação vigorosa cinco vezes durante cinco minutos cada. Agora você está pronto para o
detecção de fase.