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Bem-vindo à Série Novus Protocolo Visual.
Neste vídeo vamos aprender como executar todas as fases de um Western Blot usando o
métodos mais comuns para este ensaio.
Antes que possamos começar a preparar a mancha é preciso primeiro preparar a nossa lisado amostra.
Nesse exemplo vamos preparar um lisado de proteína a partir de células cultivadas.
Aqui nós lavar as células duas vezes com PBS gelado e tampão de lise suficiente
para cobrir as células.
A escolha do tampão de lise depende em grande parte da localização
de sua proteína de interesse.
Nós raspar as células e transferir a solução da célula em um tubo de centrífuga
colocada em gelo.
A fim de solubilizar as proteínas da membrana ligadas, que implica um reforço
detergentes de extracção em comparação com isolados de proteínas citoplasmáticas.
Neste exemplo, estamos usando um tampão RIPA padrão, que é um tampão comum
para a obtenção de um rendimento de proteína máxima. Ao extrair proteínas a partir de todos
localizações celulares,
é muito importante de modo a incluir os inibidores da protease no seu tampão de lise, que irá
prevenir a degradação da sua amostra. Sempre use protease preparada na hora
inibidores, manter amostras de gelo e trabalhar rapidamente.
Nós, os piolhos das células por pipetagem cima e para baixo
seguido de incubação em gelo durante 30 minutos.
Centrifugar as células em um pellet.
Descartar o sedimento e recolher o sobrenadante. Este é o seu lisado.
Determinar a concentração de proteína total da amostra por seu lisado
*** de uma pequena porção do lisado com uma proteína comercialmente disponível
ensaio de quantificação, tais como o BCA.
Isso vai ajudá-lo a carregar a mesma quantidade de proteína em seu gel.
Western Blots são tradicionalmente executada sob reduzida e desnaturada
condições.
Estas condições permitem que as proteínas a ser separado pelo seu peso molecular
em vez de sua forma nativa conformacional ou encargo.
Para reduzir e desnaturar as amostras,
diluir cada um em um tampão de carga, tais como o tampão de Laemmli tradicional.
Este tampão contém beta-mercaptoetanol, DTT, ou, para reduzir o dissulfureto
cumes entre cisteínas,
SDS para ajudar a fornecer uma desnaturação de proteínas líquido negativo,
glicerol para permitir que as amostras a afundar-se em cada cavidade,
azul de bromofenol a visualizar o lisado
e um buffer icônico.
Votex cada amostra e incubar a 95 graus Celsius, durante cinco minutos para
completamente desnaturar as proteínas. Agora você está pronto para carregar suas amostras em um
SDS gel página.