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Bem-vindo ao Novus série protocolo visuais
Neste vídeo você vai aprender como realizar todas as fases da fluorescente
imunocitoquímica
utilizando os métodos mais comuns para este ensaio.
Antes de iniciar o procedimento de ICC, vamos demonstrar como preparar
lamínulas e placas de cultura de células seguido pelo revestimento de nossas células.
Começamos o tratamento ácido lamínulas novos em um molar de ácido clorídrico para
24 horas.
Depois de cuidadosamente decantação do ácido e remover as lamelas de vidro,
lavamos cada um com água destilada,
em seguida, uma lavagem final com etanol.
Como um passo opcional que você pode colocar as lamelas em um rack subbing
submergir
a 0,1 mg / solução de gelatina ou polilisina
durante cinco minutos.
Estes revestimentos auxiliar no fornecimento de aderência adicional de células para o
lamínulas
assegurar que eles não são separadas durante os passos de lavagem posteriores.
Após o tratamento, remover a cremalheira subbing e secar as lamelas na cultura
capuz ou num forno aquecido.
Limpas lamelas secas são então inseridos em cada poço de uma seis bem
placa de cultura
e coberto com uma tampa.
Para poupar tempo, grandes quantidades de placas podem ser preparadas com antecedência para uso posterior.
As placas podem também ser esterilizados por colocação sob luz UV da capa.
Com lamelas de limpeza preparado em seis placas de poços,
podemos agora acrescentar nossas células.
Tecendo aqui em células de adicionar uma densidade de um meio milhão de células por cavidade.
As células são então cultivadas durante a noite na incubadora ou até que atinjam a sua preferida
densidade.
Com as células plaqueadas no dia anterior e durante a noite de cultura, estamos prontos
para iniciar o procedimento ICC.
Neste primeiro dia do ICC, vamos corrigir,
permeabilizar,
blot e adicionar um anticorpo primário às células.
Iniciar o meio de cultura por aspiração de cada poço seguido de fixação do
células com formaldeído a 4% ou 10% de formalina
durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar fixador e lavar cada poço duas vezes com PBS gelado.
Tenha cuidado para não permitir que as células secar neste
ou qualquer passo do protocolo.
Se o epítopo da sua proteína de interesse é expressa intracelularmente,
permeabilização celular é necessária para o anticorpo para obter acesso ao
célula.
Embora existam muitos diferentes
agentes permeabilização, os mais comuns são ,1-0,5%
concentração
de Tween-20
ou Triton X100
diluído em PBS.
Tween-20 é utilizado para a epitopos localizados no citoplasma
enquanto Triton X100-é utilizado para permeabilização do núcleo e as mitocôndrias.
Incubar os poços com tampão de permeabilização durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Aspirar tampão de permeabilização e lavar três vezes durante 5 minutos cada com
PBS barbante.
PBS fio contém 0,1% de Tween-20.
Vamos agora bloquear locais de ligação não específicos com tampão de bloqueio durante 1 hora
à temperatura ambiente.
O tampão de bloqueio é melhor PBST contendo soro a 10% a partir do hospedeiro
espécies de seu anticorpo secundário.
No entanto,
BSA a 1% em PBST podem também ser usados.
Preparar o anticorpo primário por diluição em tampão de bloqueio
na diluição recomendada especificada pelo datasheet.
Múltiplas diluições mais apertados são benéficas para dar conta variáveis que podem ser
diferente em seu ensaio
e para alcançar os melhores resultados.
Incubar a 4 graus Celsius, durante a noite.
No nosso exemplo,
já que estamos usando um primário não conjugada estaremos usando um fluoróforo
secundário conjugado no dia dois.
No dia dois de nosso procedimento TPI
vamos adicionar o nosso anticorpo secundário,
realizar uma marcação dupla opcional e passo marcação nuclear,
montar nossos lamínulas de slides,
e obtenção de imagens dos nossos anticorpos com um microscópio fluorescente.
Primeiro vamos aspirar solução anticorpos primária após a lavagem da célula
três vezes com PBST, durante cinco minutos cada.
Em seguida preparar o anticorpo conjugado floraform secundário que irá ligar-se ao primário
anticorpo.
Diluir o tampão de bloqueio secundário
com a diluição recomendação especificado na folha de dados
e incubada à temperatura ambiente durante uma hora.
Cobrindo as placas com película impede corantes sensíveis de degradante.
Aspirar a solução de anticorpo secundário seguido de lavagem das células
três vezes com PBST
durante cinco minutos cada.
Como etapa opcional de um segundo par primário e secundário pode ser usado
para visualizar um segundo epítopo
por meio de um andar diferente para ele.
Além disso, os corantes de ligação ao ADN, tais como DAPI
pode ser aplicada sem a necessidade de anticorpos secundários.
Consulte o Protocolo de Novus escrito completo para mais instruções sobre como dobrar e
etiqueta triplo.
Lamelas agora está pronto para ser montado em lâminas de microscópio.
Dê uma lâmina limpa e dispensar uma gota de meio de montagem Antifade por lentamente
marcação para baixo o êmbolo da pipeta.
Remova cuidadosamente uma lamela do poço,
permitir a lavagem em excesso escorrer
e colocar as células face para baixo para o slide.
Polonês unha clara pode ser usada para vedar a lamela e evitar que ele
secar.
As lâminas podem agora ser visualizados sob um microscópio
ou armazenados a -20 ou 4 graus Celsius
em uma caixa de lâminas escuras ou livro de slides.
Limitar a quantidade de tempo de cada lâmina é exposta à luz do microscópio auxiliarão na
prolongando o sinal fluorescente
e irá impedir foto branqueamento.